Monday, March 27, 2006

Pedras no caminho...

Alguém escreveu, num blog qualquer que agora não vem ao caso, esta citação bem conhecida! Espero que ela vos ajude a enfrentar este terrível mundo de trabalho e competição, mas onde também podemos encontrar bons colegas, como vocês é claro... e que todos nós no fim das nossa vidas repletas de desafios sejamos capazes de erguer castelos! Um abraço a todos...

"Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes, mas não esqueço que a minha vida é a maior empresa do mundo. E que posso evitar que ela vá à falência. Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver, apesar de todos os desafios, incompreensões e períodos de crise. Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas e se tornar um autor da própria história. É atravessar desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar um oásis no recôndito da sua alma. É agradecer a Deus a cada manhã pelo milagre da vida. Ser feliz é não ter medo dos próprios sentimentos. É saber falar de si mesmo. É ter coragem para ouvir um "não". É ter segurança para receber uma crítica, mesmo que injusta. Pedras no caminho? Guardo todas, um dia vou construir um castelo..."

Fernando Pessoa

Sunday, March 26, 2006

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Saturday, March 25, 2006

XENEB



O novo Encontro Nacional de Estudantes de Biologia irá decorrer no Porto, quem estiver interessado dirija-se ao respectivo site do XENEB.

Passem a palavra!!!

Frase do Dia

Ouvi ontem uma frase que me confortou muito, principalmente porque a ouvi quando estava a fazer novamente uma solução (pois da primeira vez tinha feito asneira, héhé). Espero que surta o mesmo efeito em vocês!


"Só não comete erros quem não trabalha" – Rita

Wednesday, March 22, 2006

Diário de um Fermentador - Dia 3

Agora que conhecemos qual o bichinho que vamos utilizar e quais os processos a que devemos realizar, é necessário escolher as estirpes com as quais se vai trabalhar, e existem três tipos de estirpes de Pichia pastoris, estas variam entre si na capacidade de usar metanol.

As estirpes Mut+ (methanol utilization plus phenotype) são as que crescem em metanol a taxas equivalentes às da wild type, encontrando-se nesta classe a maioria das estirpes existentes. Duas das famosas estirpes que pertence a esta classe são a GS115 e a X-33.

A segunda classe de estirpes é a Muts (methanol utilization slow phenotype) onde o AOX1 foi severamente delectado e substituído pelo gene ARG4 da Saccharomyces cerevisae. Visto que esta estirpe depende do promotor mais fraco AOX2 para o metabolismo do metanol, ela cresce mais lentamente na presença desta fonte de carbono. A KM71 é uma dessas estirpes. A vantagem das Muts é que utilizam menos metanol e por vezes alcançam níveis mais altos de produção de proteínas heterólogas do que as Mut+. Além do mais as Mut+ são mais sensíveis às overdoses de metanol, logo é necessário um controlo mais apertado da dosagem.

A última, classe Mut- (methanol utilization minus phenotype) representada pela estirpe MC100-3, onde ambos os genes AOX estão delectados e é totalmente incapaz de crescer em metanol. Todas estas estirpes, mesmo a Mut-, retêm a habilidade para induzir a expressão a elevados níveis do promotor AOX1.

As estirpes com que vou trabalhar são as GS115 (Mut+) e a KM71H (Muts), de forma a determinar qual é que possuem melhores performances.

Além disto vou testar também com diferentes vectores inseridos dentro das bichinhas. Em cada uma delas vou usar o vector pPICZ vazio (sem gene de interesse), o vector pPICZα vazio (sem gene de interesse) sendo o α um pequeno péptido sinal para a secreção da nossa proteína de interesse. Assim o pPICZ é para a produção intracelular e o pPICZα para a produção extracelular. Estes mutantes irão funcionar como controlos negativos. Como não se conhece muito bem o seu perfil de crescimento (pelo menos em termos de comportamento em glicerol e de seguida em metanol) vou as testar através da construção de curvas de crescimento em balões antes de os usar em fermentação semi-continua. E como controlo positivo vou testar o KM71H pPICZ::DB1 clone K (médias cópias) e o clone O (muitas cópias). Os dois “dois pontos” indicam que o gene DB1 está inserido na reading frame correcta. Mas destes é melhor falar mais tarde.

Assim tenho 6 mutantes diferentes, que serão testados em dois meios diferentes compostos por duas fases. Assim uso o BMG (bufered minimum glicerol medium) para a fase de produção de biomassa seguido BMM (bufered minimum methanol medium) para a fase de indução, este meio é um meio complexo, e muito, muito caro. O outro meio que vou testar é um meio pesquisado por mim e com algumas alterações caseiras, a este meio denominei de SM ver.4.0 (SM de Super Medium e versão 4.0, porque só funcionou correctamente à quarta tentativa de produção, pois nas versões anteriores os sais do meio precipitavam, nada que comprometa a superior qualidade da ultima versão). Este meio é completamente sintético, e é baseado essencialmente em sais, logo muito mais acessível.

Cada fermentação completa (fase de produção de biomassa + fase de indução) deve durar, cerca de 7 dias, por isso já tenho muito que fazer nas próximas semanas. Eu vou-vos contando os meus avanços. Aposto que no próximo dia já tenho novidades!

Au demain!

Saturday, March 18, 2006

Arabidopsis o verdadeiro mundo!!!


É do conhecimento geral que a Arabidopsis thaliana, uma simples erva daninha é um excelente modelo biológico, o seu genoma é pequeno e está completamente sequenciado, tem um ciclo de vida relativamente rápido (+/- 6 semanas da germinação à semente madura), transformação eficiente com a Agrobacterium tumefaciens, uma imensidão de linhas mutantes e de ferramentas disponíveis na net para avaliar níveis de expressão de determinados genes em relação por exemplo ao stress, a uma hormona, a um eliciador através dos chips de DNA. É um mundo acreditem!
Para vos contar uma parte da história, comecei por fazer download no NASCarrays dos dados referentes à expressão dos genes (cerca de 22000) a partir do AtGenExpress Project referente a alguns tipos de Stress (Osmótico, Secura, Salino…). Após isto tenho perante mim uma folha de Excel com 22000 genes, mais coisa menos coisa, a pergunta agora é o que escolher? Pois bem o meu interesse inicial baseou-se nos que eram Up-regulated e assim seleccionei os que tinham valores de expressão num determinado tempo de exposição ao stress numa proporção de mais de 2 em relação ao controlo, portanto com valores que se destaquem, é necessário ter em conta que valores de expressão abaixo de 400 pixels não são suficiente e podem ter um valor de erro associado muito grande.
Primeiro passo feito. Para cada tempo tenho alguns genes (que podem ser muitos dependendo do caso) onde é necessário seleccionar os mais interessantes, quer do ponto de vista da expressão em si, quer da informação que lhe está associada, genes demasiado documentados, ou mesmo com análise exaustiva do fenótipo não interessam visto que o objectivo é esse, escolher um gene, depois escolher uma linha mutante associada e tentar encontrar um fenótipo associado para depois caracterizar bioquimicamente em relação ao stress que provocou a sobreexpressão desse gene.
Deixo aqui alguns sites onde há ferramentas incríveis de bioinformática:
Como já tenho alguns mutantes, já os estive a "semear" em placa e também já os transpus para a terra, agora é só esperar crescer e verificar a sua homozigotia através do PCR diagnóstico, senão tenho de efectuar cruzamentos.

Ao mesmo tempo vou trabando em Molecular, géis, digestões e PCRs. Primeiro com a região promotora dos genes de interesse realizamos PCR, verificamos a existência de uma só banda com o peso molecular previsto, purificamos, digerimos, e depois vamos "colar" com um plasmídeo o pCambia1303 que já foi digerido e amplificar em E.coli. O objectivo final é poder transformar com a Agrobacteria.

Thursday, March 16, 2006

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Aconselho vivamente a visitarem o site! http://www.lpn.pt/ Em termos de conteúdo científico, infelizmente ainda não tive tempo para a analisar, porém em termos gráficos e efeitos sonoros está muito castiço!

Diário de um Fermentador - Dia 2


Agora falta saber com qual bichinho com o qual vou realizar as fermentações. E eis que surge a Pichia pastoris! É uma levedura ascoporogénica, metilotrófica, da família Saccharomycetaceae, da ordem das Saccharomycetales, que tem vindo a ser muito utilizada como hospedeiro para a expressão de uma enorme variedade de proteínas recombinantes quer a escalas de bancada quer à escala piloto.

À primeira vista a Pichia parece ser o hospedeiro ideal, visto que é um microrganismo simples, que é capaz de crescer em meios definidos baratos e produz altas densidades celulares (mais de 130 g de peso seco celular l-1) usando protocolos de fermentação bem desenvolvidos.

É usada para a expressão de proteínas heterólogas por três razões principais: pode ser facilmente geneticamente manipulada, pode expressar e excretar proteínas a elevados níveis, e possui o potencial para realizar muitas das modificações pós-transcrição tipicamente associadas com os eucariótas superiores, como o processamento de sequências sinal (quer tipo pré quer tipo prepro), folding, formação de pontes de dissulfureto, adição de certos tipos de lípidos, glicosilações O- e N- linked e processamento proteolítico.

Assim para termos a certeza que as nossas proteínas de interesse são fortemente expressas, temos de as associar a um promotor forte, e visto que algumas proteínas heterólogas podem ser tóxicas para as próprias células, se este promotor for facilmente controlável tanto melhor! De forma a iniciamos a produção das proteínas a em fases perfeitamente definidas por nós. É aqui que entra o promotor AOX1.

Numa breve explicação, existem dois genes que codificam a álcool oxidase em P. pastoris: AOX1 e AOX2, sendo o AOX1 é responsável por mais de 90% da proteína. O promotor AOX1 é induzido pelo metanol mas é reprimido por outras fontes de carbono como glucose, glicerol e etanol, e ele é: “one of the most efficient and tightly regulated promoters ever known” – Ah pois é!

A AOX catalisa o primeiro passo na via de utilização de metanol, visto que a Pichia pastoris é capaz de utilizar o metanol como única fonte de carbono, e realiza a oxidação do metanol a formaldeído e peróxido de hidrogénio. A AOX está sequestrada dentro do peroxissoma juntamente com a catalase, que degrada o peróxido de hidrogénio a oxigénio e água. Uma porção de fomaldeído gerado pela AOX abandona o peroxissoma e é posteriormente oxidado em formato e dióxido de carbono por duas desidogenases, reacções estas que são fonte de energia para as células que crescem em metanol.

A expressão do gene AOX1 é controlado ao nível da transcrição. Em células crescidas em metanol, cerca de 5% do poli(A)+ do RNA é da AOX1; porém, em células crescidas na maioria das outras fontes de carbono, AOX1 mensageiro é indetectável. A regulação do gene AOX1 parece envolver dois mecanismos: um mecanismo repressão/desrepressão e um mecanismo de indução, com uma regulação similar ao gene GAL1 da Saccharomyces cerevisiae. Ao contrário da regulação do GAL1 a ausência de uma fonte de carbono, como a glucose no meio, não resulta numa transcrição substancial da AOX1. A presença de metanol é essencial para induzir altos níveis de transcrição. Porém altas concentrações de metanol são tóxicas devido à acumulação de formaldeído e peróxido de hidrogénio dentro das células. Assim uma regulação precisa da concentração de metanol na fermentação por parte de Pichia pastoris é vital não só para manter o estado de indução dos genes que se encontram sob o controlo do promotor AOX1 mas também para prevenir a acumulação de metanol a um nível tóxico.

A expressão de proteína heteróloga sob o controlo de PAOX1 permite o design de uma estratégia de cultivo que proporcionam alta densidade celular para produção de proteínas heterólogas a níveis elevados, descritas em duas fases principais. A primeira fase tem como princípio gerar biomassa utilizando fontes de carbono que levam a uma superior produtividade substracto-biomassa, como o glicerol, uma segunda fase, na presença de metanol, para a indução da produção de proteínas heterólogas.

Amanhã vou escolher as melhores estirpes para a fermentação.

Au demain!

Tuesday, March 14, 2006

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Friday, March 10, 2006

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O Instituto de Tecnologia Química e Biológica procura seleccionar novos alunos de doutoramento para possível integração na sua equipa de investigação.
Aceitam-se candidaturas para os seguintes Laboratórios:

Control of Gene Expression Laboratory
Microbial Development LaboratoryGenomics and Stress Laboratory
Inorganic Biochemistry and NMR Laboratory
Plant Cell Biotechnology Laboratory
Plant Developmental Genetics Laboratory
Plant Molecular Ecophysiology Laboratory
Protein Modelling Laboratory
Molecular Thermodynamics Group
Organic Synthesis Laboratory
Organometallic Chemistry Laboartory
Bioorganic Chemistry Laboratory
Coordination and Supramolecular Chemistry Laboratory
Colloids, Polymers and Surfaces Laboratory

As áreas especificas de doutoramento e os respectivos supervisores podem ser encontradas em http://www.itqb.unl.pt/The_Institute/Jobs/ O financiamento destes novos alunos será efectuado através da concessão de bolsas atribuídas pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia, pelo que os candidatos seleccionados deverão obrigatoriamente concorrer a estas bolsas até 31 Março de 2006. Após avaliação pela FCT, e caso sejam seleccionados, o seu programa de trabalhos poderá iniciar-se em Janeiro de 2007. No seu primeiro ano, todos os novos alunos de doutoramento do ITQB deverão frequentar o programa de doutoramento em Ciências Químicas e Biológicas (http://www.itqb.unl.pt/Education/PhD_Programs/). As candidaturas (CV e Carta de Motivação) deverão ser enviadas por email (Assunto: Doutoramento no ITQB 2006) até ao próximo dia 15 de Março para info@itqb.unl.pt, indicando qual o laboratório pretendido. Os candidatos deverão possuir uma licenciatura (ou equivalente) numa área científica, concedida por uma instituição portuguesa ou estrangeira. Os candidatos considerados elegíveis serão contactados pelos responsáveis de laboratório para uma entrevista a realizar no ITQB, em Oeiras. O Instituto de Tecnologia Química e Biológica é um instituto da Universidade Nova de Lisboa dedicado à investigação na área das Ciências da Vida. O ITQB tem também como missão assegurar a formação avançada nas áreas da química, biologia e tecnologias associadas.
Instituto de Tecnologia Química e Biológica, ITQB-UNL
Av. Republica, EAN
Oeiras
Tel.21 4469318
www.itqb.unl.pt

Thursday, March 09, 2006

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Eventos, congressos, colóquios, cursos, jornadas, bolsas de doutoramento/mestrado/POCI, concursos, conferências... Todas terão aqui o seu espaço... Basta serem de Biologia!
Eis a primeira leva!

Sunday, March 05, 2006

Biologicamente

O TP53 é um gene supressor tumoral, localizado no cromossoma 17p13.1, sendo considerado o maior alvo de alterações genéticas em tumores humanos. Este gene codifica uma proteína, p53, que é um factor de transcrição, e está envolvida numa grande diversidade de processos celulares incluindo a regulação da transcrição genética, controlo do ciclo celular por indução de G1/S, promoção da apoptose (“guardião do genoma”), reparação do DNA, e inibição da angiogénese.
A perda de homozigotia do gene TP53 é encontrado virtualmente em todos os tipos de cancro, incluindo carcinomas do pulmão, mama, e colon. Em muitos casos, mutações que inactivam ambas as cópias do gene são adquiridas nas células somáticas. Menos comum é a herança de um alelo TP53 mutante, no entanto a herança de um só alelo predispõe o indivíduo a desenvolver tumores malignos, pois a mutação num só alelo é suficiente para inactivar o outro alelo normal (síndrome de Li-Fraumeni).
Os tumores cerebrais são pouco frequentes, no entanto, devido ao seu elevado grau de malignidade, estão associados a uma elevada taxa de mortalidade e morbilidade. Existem vários grupos histológicos, destacando-se pela sua incidência e agressividade os gliomas. O seu padrão de crescimento infiltrativo, previne a total remoção cirúrgica e a maioria destes tumores são resistentes ás modalidades de rádio- e quimioterapia. Assim sendo, o prognóstico associado a estas neoplasias é bastante reservado.
É premente o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas, e para tal é essencial clarificar as anomalias moleculares que estão na origem dos gliomas.
Deste modo, o objectivo geral do meu trabalho de estágio é avaliar a expressão do gene TP53 em gliomas humanos, de forma a identificar e caracterizar factores moleculares com implicações no diagnóstico, prognóstico e predição terapêutica deste tipo de tumores.
Já chega por hoje...!Espero que tenham gostado...!:)

Olga Martinho