Diário de um Fermentador - Dia 3

Agora que conhecemos qual o bichinho que vamos utilizar e quais os processos a que devemos realizar, é necessário escolher as estirpes com as quais se vai trabalhar, e existem três tipos de estirpes de Pichia pastoris, estas variam entre si na capacidade de usar metanol.

As estirpes Mut⁺ (methanol utilization plus phenotype) são as que crescem em metanol a taxas equivalentes às da wild type, encontrando-se nesta classe a maioria das estirpes existentes. Duas das famosas estirpes que pertence a esta classe são a GS115 e a X-33.

A segunda classe de estirpes é a Mut^s (methanol utilization slow phenotype) onde o AOX1 foi severamente delectado e substituído pelo gene ARG4 da Saccharomyces cerevisae. Visto que esta estirpe depende do promotor mais fraco AOX2 para o metabolismo do metanol, ela cresce mais lentamente na presença desta fonte de carbono. A KM71 é uma dessas estirpes. A vantagem das Mut^s é que utilizam menos metanol e por vezes alcançam níveis mais altos de produção de proteínas heterólogas do que as Mut⁺. Além do mais as Mut⁺ são mais sensíveis às overdoses de metanol, logo é necessário um controlo mais apertado da dosagem.

A última, classe Mut^- (methanol utilization minus phenotype) representada pela estirpe MC100-3, onde ambos os genes AOX estão delectados e é totalmente incapaz de crescer em metanol. Todas estas estirpes, mesmo a Mut^-, retêm a habilidade para induzir a expressão a elevados níveis do promotor AOX1.

As estirpes com que vou trabalhar são as GS115 (Mut⁺) e a KM71H (Mut^s), de forma a determinar qual é que possuem melhores performances.

Além disto vou testar também com diferentes vectores inseridos dentro das bichinhas. Em cada uma delas vou usar o vector pPICZ vazio (sem gene de interesse), o vector pPICZα vazio (sem gene de interesse) sendo o α um pequeno péptido sinal para a secreção da nossa proteína de interesse. Assim o pPICZ é para a produção intracelular e o pPICZα para a produção extracelular. Estes mutantes irão funcionar como controlos negativos. Como não se conhece muito bem o seu perfil de crescimento (pelo menos em termos de comportamento em glicerol e de seguida em metanol) vou as testar através da construção de curvas de crescimento em balões antes de os usar em fermentação semi-continua. E como controlo positivo vou testar o KM71H pPICZ::DB1 clone K (médias cópias) e o clone O (muitas cópias). Os dois “dois pontos” indicam que o gene DB1 está inserido na reading frame correcta. Mas destes é melhor falar mais tarde.

Assim tenho 6 mutantes diferentes, que serão testados em dois meios diferentes compostos por duas fases. Assim uso o BMG (bufered minimum glicerol medium) para a fase de produção de biomassa seguido BMM (bufered minimum methanol medium) para a fase de indução, este meio é um meio complexo, e muito, muito caro. O outro meio que vou testar é um meio pesquisado por mim e com algumas alterações caseiras, a este meio denominei de SM ver.4.0 (SM de Super Medium e versão 4.0, porque só funcionou correctamente à quarta tentativa de produção, pois nas versões anteriores os sais do meio precipitavam, nada que comprometa a superior qualidade da ultima versão). Este meio é completamente sintético, e é baseado essencialmente em sais, logo muito mais acessível.

Cada fermentação completa (fase de produção de biomassa + fase de indução) deve durar, cerca de 7 dias, por isso já tenho muito que fazer nas próximas semanas. Eu vou-vos contando os meus avanços. Aposto que no próximo dia já tenho novidades!

Au demain!