Alteração do Sistema de Expressão - Adeus Pichia... Olá E. coli!

Pois bem, depois de algumas optimizações e dos mais variados esforços para melhorar ao máximo o sistema de expressão Pichia pastoris, apesar das limitações logisticas e temporais, esta tem sido considerada por vários membros do projecto como um organismo não viável. Para nossa felicidade, o meu boss (Raul Machado) tem conseguido produzir uma quantidade "visível" de proteína heteróloga. Uma proteína desenhada pelo próprio, única no Mundo! Mas a sua produção foi realizada na querida amiga de todos nós: E. coli.
Assim por alguns tempos ainda vamos deixar um pouco de lado a Pichia, mas ainda vou ter que fazer mais umas brincadeiras para ver se tenho mais alguns resultados para colocar no poster que vou levar ao Congresso Nacional de Bioquímica.
Mas começam as palhaçadas com a bactéria, em breve vou aprender o Central Composite Design, de forma a optimizar as condições de produção da E. coli, sendo para esta ultima abordagem imprescindível o uso do fermentador. Mas depois explico-vos toda as graçolas envolvidas neste procedimento mal uns amigos nossos do Departamento de Engenharia Biológica mo ensinem.
Entretanto eu e o meu chefe temos construído um meio novo para E. coli com base num descrito na bibliografia (que foi completamente adulterado ao nosso bom gosto, tal como eu adoro fazer! Héhé!) mas tem algumas variantes de reagentes a utilizar, assim, vou testar como é que as bichas se portam em quatro combinações. Sim para isso vou ter que voltar a fazer curvas de crescimento! Aí vamos nós outra vez!

E agora vou partilhar convosco uma "grande" vitória pessoal: desde o início do estágio que me metia confusão o "desperdício" da coloração com cobre, isto é, solubilizávamos na altura em que acabavam de correr os géis, 5,11 g de cloreto de cobre dihidratado em 100 ml de água, de forma a coloração ser o mais fresca possível, pois com o tempo esta começa a reagir com o oxigénio e os sais precipitam. No final do processo de descoloração esta era descartada (mas não pensem que ia pela pia abaixo!). Mas agora deixou de ser assim! Nesta Sexta-Feira realizamos o design de um fantástico protocolo de reciclagem! E com a pressa de ver se era ou não funcional, o meu boss correu um gel, já fora de horas, para vermos se funcionava ou não! E eis que funcionou em pleno! Apesar da resolução ser ligeiramente mais ténue e de ter demorado mais um pouco a corar, em comparação com uma solução nova, o certo é que funcionou!
Bem, fica a promessa de um novo post em breve.
Au demain!

Cá vai alho!!!

Bem já que alguns dos meus fans (entenda-se ventoinhas) levantaram suas vozes, para que eu escrevesse algo mais sobre o meu estágio cá vai...

O principal objectivo do meu trabalho será avaliar a viabilidade de realizar testes moleculares em amostras preservadas em meios citológicos liquídos. Estes meios foram criados como uma alternativa ao tradicional teste de PapaNicolaou, em que com a ajuda de uma zaragatoa, células do colo uterino são raspadas e em seguida, espalhadas directamente numa lâmina de vidro. Com estes meios, o procedimento deste teste torna-se mais simple, menos invasivo e doloroso para as mulheres. As células são recolhidas através de uma escova endocervical, e a cabeça da escova é colocada directamente no meio de preservação líquido, onde as células ficam em suspensão. Desta forma, evitamos também a perda de grande parte do material celular recolhido como acontece no teste de PapaNicolaou.

Acredita-se ser possível realizar uma série de análises moleculares usando amostras retiradas destes meios, quer em DNA como em RNA. Mas até hoje ainda só foi comprovado ser possível realizar testes de captura híbrida. O que vou fazer agora será recolher um número significativo de amostras, usando dois meios citológicos disponíveis no mercado e vou tentar analisar vários parâmetros, como por exemplo, quantidade e qualidade de DNA e RNA extraídos destes meios, análise de polimorfismos da TP53, análise da expressão destes polimorfismos (em RNA) e análise de microssatélites no gene do EGFR...

No próximo episódio, falarei um pouco na metodologia que vou usar. Mas não se esqueçam de uma coisa, para este trabalho vou precisar de voluntários dispostos a doar um pouco de células e de sangue... e já sabem a quem eu vou recorrer!!!