Sunday, May 07, 2006

Diário de um Fermentador - Dia 4 - Avemus Proteína!

Sim! Está provado que é produzida a DB1 pela KM71H pPICZ::DB1 - clone K! A DB1, para quem anda distraído é a proteína elastomérica que pretendo produzir, e até agora, não havia a certeza de que era produzida ou não por este clone. A DB1 tem a seguinte unidade estrutural: (GVGVP GVGVP GEGVP GVGVP GVGVP GVGVP)n (GVGVP). A confirmação da sua produção ocorreu quando corri a amostra previamente purificada em gel poliacrilamida 10% em condições desnaturantes. A foto que vos demonstro aqui, representa o gel corado com coloração de cobre, e a legenda é a que se segue: rectângulo azul proteína DB1 padrão (cedida gentilmente pelo senhor Dan Urry), rectângulo vermelho a proteína que eu obtive! Entre estas duas bandas encontra-se o controlo negativo, ou seja o KM71H como vector pPICZ vazio. A coloração de cobre é muito engraçada, pois não cora proteínas mas sim tudo o resto, daí se chamar coloração inversa. E é a coloração mais fácil e rápida que eu alguma vez já vi. Este foi o primeiro passo para verificar se havia ou não produção de proteína, pois o segundo foi verificar se a dita banda simplesmente não aparecia na coloração com coomassie, visto que de acordo com a bibliografia o coomassie apenas reage com os residuos de triptofano ou reage apenas com os resíduos aminoacídicos hidrofóbicos (depende da corrente bibliográfica que queiramos seguir). A DB1 não é corada pelo comassie pois a sua conformação impede que os seus resíduos hidrofóbicos se encontrem disponíveis. E este segundo passo foi um sucesso! A banda não aparecia! Assim deveria estar mesmo muito contente. Porém descobri que o meu Super Medium não é tão infalível como julgava... Queria-lhe fazer umas alterações e torná-lo perfeito mas receio que poderá ser tarde de mais... E isso cria uma nuvem negra que me segue, pois tenho um profundo sentimento de que falhei uma das minhas missões... Logo aquela que envolvia mais directamente a minha criatividade...
Agora vou tentar desesperadamente concertar o meio, verificar se há ou não produção de DB1 no clone O, e começar finalmente as fermentações de 2L no Fermentador BioFlo 110.
Bem mal tenha noticias eu dou-vos um toque.
Au demain!

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